Гостиница Ярвил
С помощью специфических флуоресцентных красителей, выполняющих роль метки, в клетках микроорганизмов и животных клетках определяли распределение концентраций различных биополимеров, в том числе суммарного клеточного белка, двухцепочечной ДНК и клеточной РНК [29, 30]. С помощью проточных цитометров можно также следить за накоплением в отдельных клетках внутриклеточного флуоресцирующего соединения, образующегося при действии конкретного фермента. Таким путем можно устанавливать активность одного фермента в индивидуальных клетках, изучать in vitro кинетику ферментативных реакций, определять (путем клонирования гена, отвечающего данному ферменту) содержание плазмид в клетке [31]. Методом цитометрии в потоке, кроме того, можно идентифицировать и определять содержание конкретных штаммов в смешанных культурах и обнаруживать посторонние штаммы в посевном материале [32, 33]. Поскольку метод цитометрии в потоке дает информацию не только об усредненных параметрах популяции, но и о распределении характеристик индивидуальных клеток, это позволяет получить более детальные данные о состоянии популяции микроорганизмов.
Хотя в большинстве случаев методом цитометрии в потоке измеряли лишь один параметр микробиологического процесса, при помощи этого метода можно определять и несколько параметров индивидуальных клеток одновременно, что позволяет получать еще более детальную информацию о состоянии популяции клеток. При одновременном определении двух параметров результаты измерений изображают на плоскости в виде зависимости частоты или относительного числа клеток от двух изучаемых параметров, величины которых откладывают на осях координат, ограничивающих указанную плоскость. В качестве примера на рис. 10.12 приведены результаты одновременного определения интенсивности рассеяния света (связанной с размером клеток) и внутриклеточной флуоресценции, эмиссия которой происходит с участием фермента, кодируемого плазмидным геном.
Таким способом можно найти корреляцию между количеством флуоресцирующих веществ, накопленных клеткой, и наличием или даже числом плазмид в одной дрожжевой клетке. На рис. 10.12 видны два четких пика, отвечающие клеткам разных типов в изучаемой культуре. Клетки с низкой интенсивностью флуоресценции не содержат плазмид, поскольку в условиях этого эксперимента для нативных клеток типичен низкий уровень естественной флуоресценции. Часть-популяции клеток с более интенсивной флуоресценцией, зарегистрированных в виде второго четкого пика, содержит плазмиды, а следовательно, и фермент, ответственный за повышение интенсивности флуоресценции. Этот метод позволяет быстро оценить относительное содержание клеток с плазмидами и без плазмид в культуре и таким образом получить ценную информацию о репликации плазмид и процессах расщепления рекомбинантного штамма.
<< назад вперед >>